Inga fler slarvfel i generna

Sedan år 2018 har två kinesiska flickor levt med en rad dna-fel som uppstod i ett försök med gentekniken CRISPR. Med tre nya verktyg vill ­forskare nu förhindra att det ska ske fler olyckor, och föra in genredigeringen i en ny tidsålder.

Sedan år 2018 har två kinesiska flickor levt med en rad dna-fel som uppstod i ett försök med gentekniken CRISPR. Med tre nya verktyg vill ­forskare nu förhindra att det ska ske fler olyckor, och föra in genredigeringen i en ny tidsålder.

Claus Lunau & Shutterstock

Genmodifierade människor. För bara några år sedan var det science fiction, men i dag är det en realitet. Förklaringen är ­CRISPR, en enkel genteknisk upp­finning som på mindre än ett årtionde har åstadkommit en av vetenskapshistoriens största revolutioner.

CRISPR är en molekylär sax som forskarna kan förmå att söka upp en viss gen och klippa av den – och på så sätt permanent för­ändra dna.

Tekniken såg dagens ljus år 2012, och bara några år senare ingick CRISPR årligen i tusentals vetenskapliga studier och hundratals patentansökningar. Med sig förde den nya tekniken hopp om efterlängtade botemedel mot genetiska sjukdomar.

Nu har emellertid den gentekniska mirakelmetoden satt krokben för sig själv. De lovande resultaten fick en kinesisk forskare att år 2018 testa tekniken på människo­foster, och resultatet var ett par tvillingar som i dag bär på gener med egenskaper som de annars inte hade haft.

Tvillingarna utgör ett levande bevis på att gentekniken har all­varliga brister som riskerar att vålla bestående men.

Genverktyget CRISPR, som kan förändra dna, har hyllats som framtidens mirakelkur mot ärftliga sjukdomar, men den ­populära tekniken är ­inexakt och kan ge ­upphov till genetiska fel.

© Shutterstock

Gensax klipper av dna

CRISPR-metoden omfattar vanligtvis enzymet Cas9 och en kort sekvens av rna. Rna visar enzymet till en viss plats i en gen, varefter enzymet klipper av ­genen.

© Shutterstock

Forskarna saknar kontroll

Cellen reparerar hålet genom att lägga till eller ta bort dna-baser och på så sätt förena ändarna. Forskarna har ingen kontroll över den här reparationen, vilket gör att det kan lätt uppstå fel.

Trots problemen testas CRISPR fortfarande på människor. Därför arbetar forskarna med att uppdatera tekniken för att den inte ska orsaka skador på försöks-personernas dna.

Nu ska tre uppdateringar se till att CRISPR hamnar på rätt spår.

Dödligt vapen blev en succé

CRISPR, clustered regularly interspaced short palindromic repeats, är inte någon ny uppfinning.

Bakterier har i miljontals år använt systemet som ett effektivt vapen mot inkräktande virus som kan användas för att klippa sönder inkräktares dna.

Delar av ­CRISPR upptäcktes av forskare redan 1987, men först 25 år senare såg forskarna dess potential.

2012 var biokemisten Jennifer Doudna och mikrobiologen Emmanuelle Charpentier först med att använda bakteriernas vap­en för att redigera gener.

3917 vetenskapliga studier om CRISPR publicerades år 2018.

CRISPR består av ett enzym som kan klippa av dna och en bit rna som kan visa enzymet till en viss dna-sekvens. Genom att anpassa rna kunde forskarna få enzymet att klippa exakt där
de ville.

Året därpå, 2013, vidareutvecklade bio­kemisten Feng Zhang tekniken så att det till viss del även blev möjligt att sätta in en ny, specialdesignad dna-sekvens i det hål som enzymet lämnar efter sig.

Denna nya funktion används emellertid långt ifrån alltid, bland annat för att det fortfarande är oklart hur effektiv funktionen är. I stället låter forskarna ofta cellen själv reparera hålet och åstadkomma en viss förändring i genen.

Metoden hade precis uppfunnits när forskarna testade den på växt­er och djur.

2014 botade amerikanska forskare möss från ämnesomsättnings­sjukdomen tyrosinemi genom att förändra genen Fah i sjuka musungars leverceller. Samma år redigerade en annan forskargrupp apelsiners PDS-gen, som påverkar hur frukterna mognar.

CRISPR gör permanenta förändringar i dna, så eventuella slarvfel finns kvar resterande del av livet. En ny teknik kringgår detta problem genom att ­redigera ­gener utan att påverka dna.

© Shutterstock

Genetisk kod kopieras till rna

Cellen översätter dna i en gen till rna, som sedan översätts till ett protein. Avläsning av genen SCN9A leder till bildning av proteinet NaV1.7, som behövs för att vi ska uppleva smärta.

© Shutterstock

Enzymer leds till rna-sekvens

Forskarna kopplar ihop ­enzymerna Cas13 och APOBEC1 och förser dem med en bit rna. Det hjälper enzymerna att hitta till den rna- sekvens som skapar proteinet NaV1.7.

© Shutterstock

Skalpell gör om en bokstav till en annan

Enzymerna lägger sig tätt intill rna-sekvensen, varefter ­enzymet APOBEC1 skär i den ena av rna:s baser, så att en bokstav i ­koden ändras från ett C till ett U.

© Shutterstock

Ny kod ger smärtlindrande protein

Cellen översätter den förändrade rna-koden till ett protein, men förändringen i rna gör att även proteinet förändras – och det nya ­proteinet hämmar smärtsignaler.

CRISPR var en så stor succé att kinesiska forskare redan 2016 tog steget till människor.

De använde immunceller från cancer­patienter, förändrade cellernas gener i laboratoriet och injicerade de genredigerade cellerna i patienterna.

Försöket visade att de genredigerade immuncellerna är ofarliga för kroppen, men man vet fortfarande inte om cellerna kan besegra cancer.

Detta första försök på människa var ett visserligen stort men ändå ganska försiktigt steg. CRISPR injicerades i celler som tagits ut ur patienternas kropp, alltså inte direkt in i patienten, och bara en liten del av patienternas cellers dna förändrades.

CRISPR skapar fel hos spädbarn

Det förändrades 2018, då den kinesiske biofysikern He Jiankui för första gången skapade människor som var genredigerade från topp till tå. Hans mål var att skapa barn med resistens mot humant immunbristvirus (hiv), som orsakar aids. I befruktade ägg­celler från en donator ville han med hjälp av ­CRISPR skapa en viss mutation i genen CCR5.

Mutationen förekommer naturligt hos vissa människor, huvudsakligen européer, och skyddar antingen helt eller delvis mot hiv. I början av 2018 satte han i gång och i oktober samma år föddes världens första genredigerade barn – ett par tvåäggsflickor.

Forskare världen över blev chockade. He Jiankui dömdes till tre års fängelse för oetisk forskning, men någon detaljerad rapport om hans försök offentliggjordes aldrig.

Information som har läckt ut tyder dock på att forskaren kanske aldrig uppnådde sitt mål att göra tvillingarna resistenta mot hiv.

År 2018 skapade forskaren He Jiankui världens första genredigerade barn med hjälp av CRISPR.

© Shutterstock

CRISPR-verktyget klippte inte riktigt som förväntat, så i stället för den eftersträvade mutationen fick flickorna andra mutationer i CCR5, vars effekt forskarna ännu inte har kartlagt.

Samtidigt har gentekniken skapat minst en annan mutation i en helt annan del av dna. Vissa forskare tror att He Jiankui har förbisett en rad övriga mutationer som ligger dolda i tvillingarnas dna.

He Jiankui kan alltså av misstag ha fört in ett antal skadliga mutationer som nu finns överallt i flickornas kroppar, även i de könsceller som en dag kan komma att ge upphov till ytterligare barn.

Håller tummarna för mutation

Fallet med tvillingarna har satt fokus på CRISPR:s svagheter och minskat entusiasmen för den nya tekniken, men forskarna har en bra bild av var genredigeringen går snett.

I den vanligaste varianten av CRISPR används enzymet Cas9, som kommer från bakterien Streptococcus pyogenes. Cas9 klipper bokstavligt talat av dna så att det bildas två lösa ändar med rena snittytor.

När dna har klippts av försöker cellen reparera skadan, men de rena snittytorna utgör en utmaning. Dels kan cellen sätta ihop de lösa ändarna med helt andra bitar av dna som också har rena snittytor vilket gör att det uppstår nya, oväntade kombinationer av dna-­sekvenser, dels avlägsnar cellen i många fall dna-baser från de lösa ändarna eller lägger till nya baser i ändarna för att kunna sätta ihop de två ändarna på ett bättre sätt.

Resultatet är en förändring av dna som forskarna inte har full kontroll över. I mångt och myck­et får alltså forskarna hålla tummarna för att den önskade mutationen i genen ska uppstå.

Oddsen för att det ska lyckas beror på vilka förändringar de vill göra, men i de flesta fall har de bara turen med sig i några få procent av de celler som behandlas med CRISPR

18 patienter med sjukdomen LCA10 får nu CRISPR ­injicerat direkt i ögat.

En så låg andel är acceptabel när forskarna behandlar celler i laboratoriemiljö, där de kan välja ut den lilla andel celler som har fått rätt mutation.

Mer problematiskt blir det när CRISPR behöver injiceras i patienter med en genetisk sjukdom. Då riskerar man att behandlingen inte fungerar som det var tänkt.

I kombination med risken för oförutsedda mutationer i andra delar av dna kan en sådan behandling visa sig göra mer skada än nytta.

CRISPR testas nu på patienter med LCA10, en typ av ärftlig blindhet. Behandlingen ska korrigera ett genetiskt fel och återställa patienternas syn.

© Caters/Ritzau Scanpix

Ny CRISPR klipper försiktigt

Lyckligtvis arbetar flera forskare med att göra sig av med teknikens största svagheter. Ett av de verkligt stora genombrotten har gjorts av kemisten David Liu, som har ut­vecklat en ny, mer exakt variant av CRISPR som han kallar prime editing.

I Lius teknik används en ny variant av enzymet Cas9 som inte klipper dna mitt itu utan bara halvvägs igenom – så att bara den ena av dna:s två strängar kapas.

Därmed skapar prime editing, till skillnad från traditionell CRISPR, inte två lösa ändar som av misstag kan kombineras med annat dna. Dessutom bär Cas9-enzym­et med sig en konstruktionsritning till en ny dna-sekvens som forskaren vill sätta in i genen samt ett extra enzym, som kan skapa den nya dna-sekvensen med hjälp av rit­ningen.

Slutligen klipper Cas9 av den andra strängen i dna, så att den önskade föränd­ringen även sätts in där.

Vid traditionell CRISPR klipps dna av på mitten, varefter förhoppningen är att cellen ska sätta ihop bitarna igen och samtidigt rätta till felet i genen. En ny variant av CRISPR, prime editing, gör bara ett hack i dna och skriver sedan in rättelsen direkt i genen.

© Shutterstock

Gensax gör hack i genen

En ny variant av gensaxen Cas9 förses med en lång rna-sekvens. Den innehåller bland annat en del som visar ­gensaxen till den del av genen som forskarna vill förändra. Gensaxen ­klipper av genen men till skillnad från den gamla varianten av saxen kapas dna inte helt utan bara den ena av de två strängarna vilket gör att dna fortfarande hänger ihop.

© Shutterstock

Enzym skriver in nytt dna i genen

Rna-sekvensen innehåller även en konstruktions­ritning till en dna-sekvens som forskarna vill sätta in i genen. Den nya sekvensen skrivs in direkt i genen med hjälp av enzymet omvänt transkriptas, som har kopplats på gensaxen.

© Shutterstock

Den andra strängen får en kopia av ändringen

Ett tredje element i den medförda rna-sekvensen visar gensaxen till genens andra sida, så att den kan klippa av den andra dna-strängen. När det
är gjort kopierar cellen den dna-sekvens som har satts in i den första dna-strängen. Därefter ­innehåller båda strängarna den önskade sekvensen.

© Shutterstock

Förändring påverkar kroppen permanent

Genen innehåller nu en helt ny sekvens av dna-baser som kan påverka cellen – och kanske hela kroppen. Ingreppet kan exempelvis korrigera mutationer som annars ger upphov till sjukdomar. Den nya sekvensen ärvs av båda ­cellens avkommor när den delas, vilket gör förändringen permanent.

2019 visade David Liu att han med hjälp av prime editing kunde byta ut en enda dna-bas i en gen med upp till 55 procents till-förlitlighet.

Dessutom kunde kemisten utforma systemet på ett sätt som gjorde att det antingen avlägsnade eller satte in hela sekvenser av dna-baser, detta med ända upp till 78 procents tillförlitlighet.

Lius teknik används redan av andra forskare. 2020 använde en nederländsk forskargrupp metoden för att korrigera genetiska fel i små delar av sjuk vävnad som de hade tagit från patienter och odlat i laboratoriemiljö.

Forskarna satte in tre extra dna-baser i genen DGAT1 och kunde på så sätt avlägsna den genetiska orsaken till en svår ärftlig form av diarré som gör det näst intill omöjligt att ta upp näring ur livsmedel.

Genredigering undviker gener

Risken att CRISPR orsakar permanentskada i dna kan även minskas på ett annat sätt, nämligen genom att skapa genetiska förändringar utan att påverka själva genen.

Gener fungerar som konstruktions­ritningar vid proteinbildning, och målet med att redigera en gen är i de flesta fall att förändra proteinet.

2017 utvecklade bio-kemisten Feng Zhang en variant av CRISPR som förändrar proteinet genom att påverka ett steg som ligger mellan avläsningen av genen och framställningen av proteinet.

1303 patentansökningar där ­CRISPR ingick registrerades runtom i världen år 2017.

När cellen bildar ett protein översätter den först en viss gen till en rna-sekvens, som därefter bär med sig genens instruktioner till cellens proteinfabrik.

Zhangs nya teknik korrigerar rna-sekvensen, inte själva genen, men uppnår samma resultat. Fördelen med det är att rna (till skillnad från dna) kontinuerligt bryts ner i cellen, så när forskarna avbryter behandlingen försvinner alla förändringar, vilket innebär att cellens arvsmassa inte ris­kerar permanenta skador.

Metoden lämpar sig väl för behandlingar som kräver en förändring av cellernas proteiner bara under vissa perioder, till exempel vid huvudvärk och andra typer av smärta då proteiner som styr nervcellernas smärtsignaler tillfälligt kan sättas ur spel.

Proteinbildningen kan även påverkas av en tredje ny CRISPR-variant, som varken korrigerar dna- eller rna-sekvenser.

I stället avlägsnar den metylgrupper, små molekyler som fäster på dna och förhindrar att en gen översätts till rna och protein. Metylgruppernas blockering kan orsaka sjukdomar, så genom att avlägsna dessa kan forskarna behandla dem.

CRISPR korrigerar fel i dna, men alla genetiska sjukdomar beror inte på fel i den genetiska koden. Personer med fragil X-syndromet har till exempel en felfri FMR1-gen och ändå fungerar den inte som den ska. Orsaken är en molekylär blockad av dna. En ny typ av CRISPR ska nu användas för att bryta blockaden.

© Shutterstock

Oönskade molekyler ­stänger av viktig gen

Fragil X-syndromet, som kan leda till utvecklingsstörningar, orsakas av att så kallade ­metylgrupper täcker genen FMR1. Det gör att genen stängs av så att cellen inte kan ­bilda det protein som genen kodar för.

© Shutterstock

Fusionerat enzym spårar sjukt dna

Forskarna sätter in ett modifierat CRISPR-verktyg i cellerna. Det utgörs av en bit guide-rna som kan spåra genen FMR1 samt ett inaktivt Cas9-enzym som är kopplat till ett annat enzym: TET1.

© Shutterstock

Vasst knivblad förstör blockad

TET1-enzymet avlägsnar ­metylgrupperna från genen. När genen är ren kan cellen återigen avläsa dess kod och bilda proteinet, som nu kan fylla sin normala funktion i cellen.

Metoden har dock ännu större potential än så.

Metylgrupper spelar en viktig roll vid allt från autism till cancer, vilket innebär att man genom att avlägsna dem kan få behandlingar som är otänkbara med traditionell CRISPR.

CRISPR injiceras i ögat

ftersom tekniken CRISPR i allt större omfattning testas på människor i nuläget behöver den förbättras omgående.

I mars 2020 inledde den amerikanske ögonläkaren Mark Pennesi ett försök där CRISPR injiceras direkt under ögats näthinna på ett antal patienter som lider av en typ av ärftlig blindhet, Lebers kongenitala amauros 10 (LCA10).

Sjukdomen orsakas av en medfödd mutation i genen CEP290.

CRISPR-­behandlingen ska klippa ut mutationen ur genen i patienternas näthinnor och för­hoppningen är att patienterna på så sätt ska återfå synen.

Metoden har gett lovande resultat på möss, men det finns ännu inga resultat från försök på människa. Förhoppningsvis fungerar den som planerat, det finns dock en risk att den även ger oönskade mutationer hos patienterna, precis som hos He Jiankuis kinesiska tvillingar.